口腔黏膜下纤维性变癌变的发生机制研究进程

作者：张大河，周晌辉，上海交通大学附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面-头颈肿瘤科

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部恶性肿瘤中最常见的类型之一，大部分OSCC由癌前病变演变而来，而口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis,OSF）就是OSCC的癌前病变之一。OSF是一种慢性、隐匿性口腔黏膜疾病，与经常性咀嚼槟榔有关，好发于东南亚以及中国的湖南、海南等地，具有明显的地域性。OSF是一种基于临床症状和组织病理学的诊断，其特征是由于细胞外基质沉积过多而引起的口腔炎症、上皮萎缩、开口受限等，主要病理表现为口腔黏膜下固有层胶原异常堆积。

OSF的早期表现是炎症及血管充血，中期血管减少并发生纤维化，可见口腔黏膜变为白色，呈大理石样改变。到OSF的晚期，血管闭塞，会出现一条纤维带，使得患者开口明显受限，进一步导致患者口腔卫生、言语、咀嚼甚至吞咽方面的问题。随着OSF的进展，3%～19%的患者可能发生癌变，且这一概率逐年上升。但OSF癌变的发生机制尚不清楚，本文对目前有关OSF癌变机制的研究进展作一综述。

1.咀嚼槟榔与OSF恶性进展的关系

嚼槟榔的习惯被认为是OSF发生和恶性进展的最可能的因素，尤其是槟榔与烟一起咀嚼，显著增加了OSF癌变的可能。流行病学资料和干预研究也表明，槟榔是OSF癌变的主要病因之一，而且OSF癌变与嚼食槟榔的量和持续时间呈正相关。2003年，世界卫生组织将槟榔列为一级致癌物。

1.1槟榔碱和多酚

槟榔中含有多种物质，如生物碱、多酚以及亚硝胺等。其中生物碱组分主要是槟榔碱、四氢烟酸等，多酚包括儿茶素、丹宁酸、白花色素苷等。槟榔碱和多酚是槟榔中的主要致癌物，两者可以通过直接对口腔各类细胞的毒性作用诱导OSF发生，进而进展为癌症，而且也可以通过刺激各种利于癌症形成的细胞因子，达到促进癌症发生的目的。

1.2槟榔中的微量元素

槟榔中含有多种微量元素，如铜、钴、溴、钒、锰、氯和钙等。其中可溶性铜含量很高，可以通过咀嚼进入口腔，上调赖氨酸氧化酶（lysine oxidase enzyme,LOX）的活性。LOX是一种铜活化酶，能够促进胶原的交联和细胞外基质生成。有研究证实了LOX在OSF组织和成纤维细胞中表达上调，而且在体外实验中，不同浓度的铜也能促进成纤维细胞增殖，说明铜可能是一种纤维化介质。

在老年OSF患者中，LOXArg158Gln表达明显上调，说明铜离子对LOX的影响在OSF的发生、发展中起到了重要作用。另外，有研究发现，钴在咀嚼槟榔相关的OSF患者血清中的含量显著上升，可能与槟榔及其包装物中的过量钴有关。虽然尚无证据证明钴参与了OSF的癌变过程，但其含量增加在其他上皮恶性肿瘤中也曾被发现，提示了其重要性。

1.3槟榔导致细胞外基质堆积

OSF病变的实质是胶原纤维等细胞外基质分子（extracellular matrix molecules,ECM）合成增加和降解不足，在口腔黏膜下过度堆积。所以基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）及其抑制物TIMPs（tissue inhibitors of metalloproteinase）之间的平衡紊乱，被认为在OSF恶性进展过程中发挥了重要作用，直接导致了ECM的堆积。有研究证实，槟榔碱在DNA水平和蛋白水平均可干扰TIMPs和MMPs之间的平衡。

在OSF进展过程中，MMP-2和TIMP-2的表达同步增加，证明了蛋白酶是OSF发病和进展过程中的重要介质，并且参与了OSF的恶性转化过程。转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一种多功能细胞因子，在上皮细胞中能够诱导细胞凋亡和上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）的发生，而且还能抑制抗纤维化因子骨成形蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP7）的表达，进而增加细胞外基质中胶原的堆积。通过基因表达图谱分析发现，在槟榔碱和多酚的作用下，上皮细胞中如TGF-β2、SMAD3、FN1等多种TGF-β信号的目的基因表达上调。证明槟榔能够使上皮细胞中TGF-β信号通路的活性上升，进而导致OSF的发生和发展。

1.4槟榔导致细胞增殖异常

OSF发生癌变的过程中，槟榔引起了许多因子，如p21和p27、BRCA1和BRCA2的异常表达，导致细胞周期与细胞凋亡的改变，进而导致了细胞增殖异常，促进了OSF的恶性进展。

1.4.1p21和p27表达下调

槟榔提取物可以直接导致口腔内细胞的异常增殖，通过诱导p21和p27表达下调，进而导致细胞内氧自由基产生、抑制mTORC1信号途径。mTORC1信号途径有自噬抑制作用，此途径被抑制后，细胞自噬作用增强。且p21和p27对细胞周期的维持有重要作用，其下调增加了DNA损伤的概率，进而增加了OSF癌变的可能性。

1.4.2BRCA1和BRCA2的表达下调

BRCA1和BRCA2是抑癌基因，有助于错误DNA的修复，参与维持基因组的完整性。槟榔提取物会抑制BRCA1和BRCA2的表达，且由于BRCA1和BRCA2蛋白水平的降低以及BRCA1基因外显子11的突变，引起基因组不稳定性，导致增殖异常。这可能是导致OSF癌变的一个重要原因。

1.4.3Survivin磷酸化

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）是凋亡分子机制的关键调控者，其家族成员survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是极强的凋亡抑制因子；还能调节细胞的有丝分裂，主要在有丝分裂的G2/M期产生。p34cdc2则可以使survivinThr34磷酸化，活化survivin。研究发现，p-survivin随着OSF进展而表达逐渐增强，在OSCC组织中的表达达到最高；而p34cdc2-cyclinB1的表达也是如此。这既抑制了细胞凋亡，也导致了细胞的过度增殖。更进一步的研究表明，survivin可作为OSF癌变发生的肿瘤标志物，从而用于早期检测和发现OSF癌变。

2.低氧和血管生成

血管生成是再生和修复的关键机制，在各种病理条件下也起着重要作用。最新的观点认为，OSF本质上是口腔黏膜慢性物理、化学和机械损伤后的过度修复，而血管生成和炎症反应本身正是组织损伤后修复和创伤愈合的重要生理过程。在OSF进展过程中，炎症、组织缺氧等因素会刺激血管生成，但是不成熟的血管无法改变缺氧状态，反而导致更多的细胞因子产生，进而刺激ECM的生成和堆积，促进纤维化进程。在OSF发生、发展过程中，病理性血管生成可能与进展性纤维化有关，进而促进了其恶性进展。

2.1低氧

在OSF早期出现的低氧被认为在OSF转化和进展中起着重要作用，因其能诱导低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的产生和活化。已经证实，在OSF中，HIF-1α在蛋白质水平和mRNA水平都表达上调，且与上皮异形性有关。HIF-1α在正常组织、OSF及OSF相关OSCC中表达强度逐渐增加。

HIF-1α可以通过诱导各种生长因子和介质的产生来促进修复和血运重建，尤其是诱导血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的生成。VEGF是一类促血管生成因子，能刺激血管内皮细胞增殖以及新生血管的形成，对肿瘤的发生、发展、转移起到重要作用。所以早期OSF组织中可以见到新生血管的生成，但可能由于这些新形成的血管效率低和不成熟，无法纠正组织缺氧，所以慢性低氧状态始终存在，导致HIF-1α的持续产生；而HIF-1α还可以诱导多种纤维化相关因子的产生，如TGF-β1、PAI-1等，促进组织纤维化进程。另外，HIF-1α表达上调与OSF的恶性进展有关。

2.2OSF中的血管生成

在OSF进展过程中，血管生成一直存在争议。传统观点认为，在OSF中，随着纤维化的进展，血管持续减少。但新的研究发现，在OSF早期可见组织中大量新生血管及明显的炎症反应，血管密度呈上升趋势；而在OSF晚期，血管密度则呈下降趋势。早期新生血管增加，是在持续低氧环境、大量炎症因子、炎细胞浸润等多种因素作用下发生的；而晚期血管密度下降，则与基质密度增加所产生的物理屏障作用有关。

之后，随着OSF恶性进展的发生，血管生成再次呈上升趋势。最新研究发现，VEGF、CD34和PCNA从OSF到OSCC，表达呈显著上调趋势，导致细胞增殖异常和血管增多，表明它们可能在OSF的恶性转化中发挥重要作用。

3.EMT与OSF恶性进展的关系

EMT是一个生物学过程，能使极化的上皮细胞进行多种化学变化，最终呈现出间质细胞表型，包括增强的迁移力、侵袭力等，也能提高ECM的生成；它也是组织纤维化及癌症形成过程中的重要步骤，且已经证实咀嚼槟榔导致的OSF与EMT激活因子有关。

3.1黏膜成纤维细胞与肌成纤维细胞

在成纤维细胞中，槟榔并未发现诱导TGF-β信号；但最新一项研究强调了槟榔提取物对黏膜成纤维细胞的活化作用，表明其参与了与肌动蛋白丝聚合相关的PLC/IP3/Ca2+/Calmodulin和Rho信号通路，说明槟榔对黏膜成纤维细胞也会产生影响，进而促进OSF进展。

有研究显示，槟榔提取物增强了TGF-β介导的纤维母细胞的活性，而且这种作用可以通过上皮-间充质的相互作用而增强。αvβ6是整合素家族成员，能促进组织纤维化和癌变；而槟榔碱能激活αvβ6在口腔角化细胞中的表达，继而能促进TGF-β1的表达，最终让成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。在创伤愈合和器官纤维化过程中，肌成纤维细胞是分泌胶原和重组ECM的主要细胞类型，其典型的分子特性是α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤连蛋白的表达。

锌指蛋白类转录因子ZEB1是EMT程序激活的重要因子，作为转录抑制因子负调节极性标志物如E-cadherin、MucI和Pkp3的表达。有研究证实，在颊黏膜成纤维细胞（buccal mucosal fibroblasts，BMFs）中，槟榔碱能诱导α-SMA和ZEB1的表达，且ZEB1在咀嚼槟榔相关OSF中表达显著增加。另外该研究还检测到，ZEB1与α-SMA启动子的Ebox区相交联，激活其活性。提示咀嚼槟榔增加了黏膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的可能性，进而促进了OSF的恶性进展。

3.2Snail和Slug

一些EMT诱导转录因子，如Snail和Slug，已经被发现可以通过抑制E-cadherin来启动和促进间充质表型的获得。在OSF组织中，Slug也显示出上调表达，并与多种肌成纤维细胞标志物相关；而BMFs中，Slug的过表达刺激了肌成纤维细胞的活性，提示槟榔碱上调Slug，有助于肌成纤维细胞的转化；最重要的是，Slug能够与I型胶原蛋白的E-box区结合，导致I型胶原蛋白表达增加。说明Slug在OSF中异常升高及其在槟榔碱诱导成纤维化中有重要意义，而且Slug下调可以成为OSF治疗的潜在靶点。另外，Snail也能够与α-SMA启动子的E-box区交联，进而刺激BMFs转化为肌成纤维细胞。

4.表观遗传调控促进OSF癌变进程

表观遗传指基因表达中的多种变化，是人体中一种十分重要的调控机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。近年来，在表观遗传学方面对OSF癌变的机制研究也取得了一些进展。上述的ZEB1和Snail与α-SMA启动子的E-box区交联诱导EMT的发生，也属于表观遗传学范畴。

4.1Wnt/β-catenin信号通路的过度活化

Wnt/β-catenin信号通路的过度活化已被确定在多种肿瘤包括OSCC的发生和发展中扮演重要角色，包括细胞增殖、分化和黏附等方面，其改变可能导致细胞过度增殖。Wnt抑制因子1（WIF-1）是一种Wnt拮抗剂，其下调和甲基化已在多种恶性肿瘤中被证实。在OSF中，WIF-1随OSF进展而表达减少，在OSCC组织中表达更少。

在有嚼槟榔习惯的OSCC病例中，WIF-1常被甲基化；但在正常口腔黏膜组织和OSF组织的不同分期中则没有，提示WIF-1甲基化在OSF的恶性进展过程中具有肿瘤特异性。分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled-related proteins,SFRPs）是最先被发现的Wnt拮抗剂，被认为在多种人类癌症中通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制肿瘤的发展。

在OSF癌变进程中，SFRP1和SFRP5在RNA和蛋白质水平都表现出表达下调；且SFRP1和SFRP5的启动子在正常口腔黏膜组织中未出现甲基化，但在OSF进展过程中逐渐表现出甲基化，且在OSCC组织中甲基化程度达到最高。说明在OSF癌变过程中，SFRP1和SFRP5启动子的高甲基化可能导致两者表达下调，对OSF癌变起到了重要作用。

4.2TP53启动子高甲基化

p53是一种非常关键的转录因子，也是一种极为重要的抑癌基因，槟榔能下调其表达。另外，使用槟榔碱处理口腔黏膜成纤维细胞可降低p53及其下游分子的表达，这是由于槟榔碱刺激会导致TP53启动子的高甲基化，进而可能促进了OSF的恶性进展。

4.3COX-2高甲基化

COX-2是一种直接的早反应蛋白，由生长因子、癌基因、致癌物等触发产生，槟榔提取物也能导致其表达上调。p53由TP53基因编码，是一种非常关键的转录因子；而p53与MDM2癌蛋白的交联可以负调控p53的表达，所以抑制MDM2-p53信号通路是一种很重要的治疗方法。

研究发现，COX-2和MDM2的表达随着OSF的进展逐步增强，且COX-2的表达增强与OSF癌变有很强的相关性，MDM2的表达增强与放疗失败呈正相关，提示COX-2可以作为OSF癌变的肿瘤标志物，而MDM2表达对临床治疗可以起指导作用。另外，COX-2和E-cadherin在慢性OSF中表现出高甲基化，说明COX-2高甲基化在OSF恶性进展过程中可能起到了重要作用。

4.4miRNA水平调控

miR-22是许多癌症的肿瘤抑制因子，能够抑制癌细胞增殖、迁移等。p53能诱导miR-22的表达，而槟榔提取物恰恰抑制了p53的表达，进而抑制了口腔癌细胞中miR-22的表达。c-Myc是多种靶基因的转录因子和抑制因子，主要参与细胞增殖过程，而且c-Myc也能直接抑制miR-22的表达。有研究证实，槟榔提取物上调OSCC细胞中c-Myc的表达，进而抑制miR-22的表达，使得后者无法发挥抑癌作用。提示miR-22的异常表达对OSF的恶性进展起到了重要作用。另外有研究发现，miR-31在OSF组织、口腔癌组织中表达上调，说明miR-31的异常表达可能在OSF的恶性进展过程中也发挥了重要作用。

总之，深入研究OSF的癌变机制，有望找到相关分子标志物及治疗靶点，有助于为OSF癌变的早期诊断、早期治疗提供策略，最终提高OSCC的5年生存率。

来源：张大河,周晌辉.口腔黏膜下纤维性变癌变的发生机制研究进展[J].中国口腔颌面外科杂志,2020,18(01):71-76.